Metode penelitian biologi molekuler memainkan peran besar dalam kedokteran modern, forensik, dan biologi. Berkat kemajuan dalam studi DNA dan RNA, seseorang dapat mempelajari genom suatu organisme, menentukan agen penyebab suatu penyakit, mengenali asam nukleat yang diinginkan dalam campuran asam, dll.
Metode penelitian biologi molekuler. Apa itu?
Kembali ke tahun 70-an dan 80-an, para ilmuwan untuk pertama kalinya berhasil menguraikan genom manusia. Acara ini memberikan dorongan bagi perkembangan rekayasa genetika dan biologi molekuler. Studi tentang sifat DNA dan RNA telah mengarah pada fakta bahwa sekarang dimungkinkan untuk menggunakan asam nukleat ini untuk mendiagnosis penyakit, mempelajari gen.
Memperoleh DNA dan RNA
Metode diagnostik biologi molekuler memerlukan adanya bahan awal: lebih sering berupa asam nukleat. Ada beberapa cara untuk mengisolasi zat-zat ini dari sel-sel organisme hidup. Masing-masing dari mereka memiliki kelebihan dan kekurangannya sendiri, dan itu perlupertimbangkan saat memilih metode untuk mengisolasi asam nukleat murni.
1. Mendapatkan DNA menurut Marmur. Metode ini terdiri dari perlakuan campuran zat dengan alkohol, sebagai akibatnya DNA murni mengendap. Kerugian dari metode ini adalah penggunaan zat agresif: fenol dan kloroform.
2. Isolasi DNA menurut Boom. Zat utama yang digunakan di sini adalah guanidin tiosianat (GuSCN). Ini berkontribusi pada pengendapan asam deoksiribonukleat pada substrat khusus, yang selanjutnya dapat dikumpulkan menggunakan buffer khusus. Namun, GuSCN adalah penghambat PTC, dan bahkan sebagian kecil darinya yang masuk ke dalam DNA yang diendapkan dapat mempengaruhi jalannya reaksi berantai polimerase, yang memainkan peran penting dalam bekerja dengan asam nukleat.
3. Sedimentasi kotoran. Metodenya berbeda dari yang sebelumnya karena bukan molekul asam deoksiribonukleat yang diendapkan, tetapi pengotor. Untuk melakukan ini, penukar ion digunakan. Kekurangannya adalah tidak semua zat dapat mengendap.
4. Penyaringan massal. Metode ini digunakan dalam kasus di mana informasi yang tepat tentang komposisi molekul DNA tidak diperlukan, tetapi perlu untuk mendapatkan beberapa data statistik. Hal ini dijelaskan oleh fakta bahwa struktur asam nukleat dapat rusak bila diolah dengan deterjen, khususnya alkali.
Klasifikasi Metode Penelitian
Semua metode penelitian biologi molekuler dibagi menjadi tiga kelompok besar:
1. Amplifikasi (menggunakan banyak enzim). Di Sinimengacu pada PCR - reaksi berantai polimerase, yang memainkan peran besar dalam banyak metode diagnostik.
2. Tidak memperkuat. Kelompok metode ini berhubungan langsung dengan operasi campuran asam nukleat. Contohnya adalah 3 blot, hibridisasi in situ, dll.
3. Metode berdasarkan pengenalan sinyal dari molekul probe yang mengikat DNA atau RNA probe tertentu. Contohnya adalah Hybride Capture System (hc2).
Enzim yang dapat digunakan dalam metode penelitian biologi molekuler
Banyak metode diagnostik molekuler melibatkan penggunaan berbagai macam enzim. Di bawah ini adalah yang paling umum digunakan:
1. Enzim restriksi - "memotong" molekul DNA menjadi bagian-bagian yang diperlukan.
2. DNA polimerase - mensintesis molekul asam deoksiribonukleat beruntai ganda.
3. Reverse transcriptase (revertase) - digunakan untuk mensintesis DNA pada template RNA.
4. DNA ligase - bertanggung jawab untuk pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida.
5. Exonuclease - menghilangkan nukleotida dari bagian terminal molekul asam deoksiribonukleat.
PCR adalah metode utama amplifikasi DNA
Polymerase chain reaction (PCR) secara aktif digunakan dalam biologi molekuler modern. Ini adalah metode di mana sejumlah besar salinan dapat diperoleh dari satu molekul DNA (molekul diperkuat).
Fungsi utama PCR:
- diagnostikpenyakit;
- kloning segmen DNA, gen.
Elemen berikut diperlukan untuk melakukan reaksi berantai polimerase: molekul DNA awal, DNA polimerase termostabil (Taq atau Pfu), deoksiribonukleotida fosfat (sumber basa nitrogen), primer (2 primer per 1 molekul DNA) dan sistem buffer itu sendiri, di mana semua reaksi dimungkinkan.
PCR terdiri dari tiga langkah: denaturasi, primer annealing dan elongasi.
1. Denaturasi. Pada suhu 94-95 derajat Celcius, ikatan hidrogen antara dua untai DNA terputus, dan sebagai hasilnya kita mendapatkan dua molekul beruntai tunggal.
2. Anil primer. Pada suhu 50-60 derajat Celcius, primer melekat pada ujung molekul asam nukleat beruntai tunggal dengan tipe komplementaritas.
3. Pemanjangan. Pada suhu 72 derajat, sintesis molekul untai ganda putri asam deoksiribonukleat terjadi.
pengurutan DNA
Metode penelitian biologi molekuler seringkali membutuhkan pengetahuan tentang urutan nukleotida dalam molekul asam deoksiribonukleat. Sequencing dilakukan untuk menentukan kode genetik. Diagnostik molekuler masa depan akan didasarkan pada pengetahuan yang diperoleh dari sekuensing manusia.
Jenis pengurutan berikut dibedakan:
- Pengurutan Maxam-Gilbert;
- Pengurutan penyanyi;
- pyrosequencing;
- nanoporipengurutan.
