Apa yang mendasari hibridisasi DNA? Meskipun urutan DNA untai ganda umumnya stabil dalam kondisi fisiologis, mengubah kondisi ini di laboratorium (biasanya dengan menaikkan suhu lingkungan) akan menyebabkan molekul terpisah menjadi untaian individu. Yang terakhir saling melengkapi satu sama lain, tetapi juga dapat melengkapi urutan lain yang ada di lingkungan mereka. Menurunkan suhu sekitar memungkinkan molekul beruntai tunggal untuk menyatu atau "berhibridisasi" satu sama lain. Ini adalah metode hibridisasi DNA.
Konsep dari sudut pandang biologi molekuler
Para ilmuwan yang terlibat dalam replikasi DNA dan transkripsi DNA menjadi RNA mengandalkan persilangan nukleotida dan teknik biologi molekuler. Ini termasuk blot Selatan dan Utara, reaksi berantai polimerase (PCR), dan sebagian besar pendekatan hibridisasi dan pengurutan DNA-RNA.
Aplikasi
Hibridisasi adalah sifat utama nukleotidaurutan dan digunakan dalam berbagai metode biologi molekuler. Hubungan genetik keseluruhan dari dua spesies dapat ditentukan dengan menghibridisasi segmen DNA mereka (hibridisasi DNA-DNA). Karena kesamaan urutan antara organisme yang terkait erat, suhu yang lebih tinggi diperlukan untuk melelehkan hibrida DNA tersebut dibandingkan dengan organisme yang lebih jauh. Berbagai metode menggunakan hibridisasi untuk menentukan asal sampel DNA, termasuk reaksi berantai polimerase (PCR). Dalam metode lain, sekuens DNA pendek dihibridisasi ke mRNA seluler untuk mengidentifikasi gen yang diekspresikan. Perusahaan farmasi sedang menjajaki penggunaan RNA antisense untuk mengikat mRNA yang tidak diinginkan, mencegah ribosom menerjemahkan mRNA menjadi protein.
Hibridisasi DNA-DNA umumnya mengacu pada teknik biologi molekuler yang mengukur tingkat kesamaan genetik antara kumpulan urutan DNA. Ini biasanya digunakan untuk menentukan jarak genetik antara dua organisme. Telah banyak digunakan dalam filogeni dan taksonomi.
Metodologi
DNA dari satu organisme diberi label, kemudian dicampur dengan DNA tidak berlabel yang dapat dibandingkan dengannya. Campuran diinkubasi untuk memungkinkan untai DNA berdisosiasi dan kemudian didinginkan untuk membentuk DNA untai ganda hibrida yang diregenerasi. Urutan hibridisasi dengan tingkat kemiripan yang tinggi akan mengikat lebih erat dan membutuhkan lebih banyak energi untuk memisahkannya: yaitu, mereka terpisah ketika dipanaskan pada suhu yang lebih tinggi.suhu daripada urutan yang berbeda, proses yang dikenal sebagai "pelelehan DNA".
DNA mencair
Mengevaluasi profil peleburan DNA hibridisasi, DNA untai ganda terikat pada apa yang disebut "kolom" dan campuran yang dihasilkan dipanaskan. Pada setiap langkah, kolom dicuci dan urutan DNA yang meleleh menjadi untai tunggal dan mencuci kolom. Suhu di mana DNA berlabel keluar dari kolom mencerminkan jumlah kesamaan antara urutan (dan pola pelipatan sendiri berfungsi sebagai kontrol). Hasil ini digabungkan untuk menentukan tingkat kesamaan genetik antar organisme. Menurut mikrobiologi modern, hibridisasi DNA tidak mungkin terjadi tanpa memahami hal-hal ini.
Ketika beberapa spesies asam ribonukleat (atau deoksiribonukleat) dibandingkan dengan cara ini, nilai kesamaan memungkinkan spesies untuk ditempatkan di pohon filogenetik. Oleh karena itu, ini adalah salah satu pendekatan yang mungkin untuk melakukan sistematika molekuler. Charles Sibley dan John Ahlquist, pelopor teknik ini, menggunakan hibridisasi DNA-DNA untuk mempelajari hubungan filogenetik burung (taksonomi Sibley-Ahlquist) dan primata.
Penting bagi biologi
Hibridisasi DNA-DNA adalah standar emas untuk membedakan spesies bakteri, dengan nilai kesamaan lebih dari 70%, menunjukkan bahwa galur yang dibandingkan termasuk dalam spesies yang berbeda. Pada tahun 2014, ambang batas 79% kesamaan diusulkan untuk memisahkan subspesies bakteri.
Kritik berpendapat bahwa teknik ini tidak akurat untuk membandingkan spesies yang berkerabat dekat, karena setiap upaya untuk mengukur perbedaan antara urutan ortologi antara organisme diliputi oleh hibridisasi rekan paralogus dalam genom organisme. Urutan DNA dan perbandingan urutan komputasi saat ini merupakan metode yang umum digunakan untuk menentukan jarak genetik, meskipun pendekatan ini masih digunakan dalam mikrobiologi untuk membantu mengidentifikasi bakteri.
Cara saat ini adalah melakukan hibridisasi DNA-DNA dalam silikon menggunakan genom yang diurutkan seluruhnya atau sebagian. GGDC yang dikembangkan oleh DSMZ adalah alat paling akurat yang diketahui untuk menghitung nilai seperti DDH. Di antara perbaikan algoritmik lainnya, ini memecahkan masalah dengan urutan paralogous dengan menyaringnya dengan hati-hati dari kecocokan antara dua urutan genom.
METODE IKAN
Fluoresensi In Situ Hibridisasi (FISH) adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk mendeteksi dan mengurutkan DNA, seringkali pada kromosom tertentu.
Pada tahun 1969, Joseph Gall dan Mary Lou Pardu menerbitkan sebuah makalah yang menunjukkan bahwa salinan radioaktif dari urutan DNA ribosom dapat digunakan untuk mendeteksi urutan DNA komplementer dalam inti telur katak. Sejak pengamatan asli ini, banyak penyempurnaan telah meningkatkan keserbagunaan dansensitivitas prosedur sedemikian rupa sehingga hibridisasi in situ ("di tempat", Latin) sekarang dianggap sebagai alat penting dalam sitogenetika. (Istilah in situ sekarang juga digunakan untuk merujuk pada tahap awal pertumbuhan karsinoma, ketika hanya jaringan epitel yang terlibat dalam proses patologis.)
Urutan hibridisasi fluoresen
Probe
RNA dapat dirancang untuk gen apa pun atau urutan apa pun di dalam gen untuk memvisualisasikan lncRNA dan miRNA mRNA dalam jaringan dan sel. IKAN digunakan dengan mempelajari siklus reproduksi sel, khususnya interfase inti untuk setiap kelainan kromosom. FISH memungkinkan Anda untuk menganalisis serangkaian besar kasus arsip, jauh lebih mudah untuk mengidentifikasi kromosom yang diidentifikasi dengan membuat probe dengan basis kromosom buatan yang akan menarik kromosom serupa.
Sinyal hibridisasi untuk setiap probe ketika kelainan nuklir terdeteksi: setiap probe deteksi mRNA dan lncRNA terdiri dari 20 pasang oligonukleotida, setiap pasangan mencakup ruang 40-50 bp. p. Probe menggunakan bahan kimia eksklusif untuk mendeteksi mRNA.
Hibridisasi dengan probe DNA
Probe sering dibuat dari fragmen DNA yang telah diisolasi, dimurnikan, dan diperkuat untuk digunakan dalam desain genom manusia. Ukuran genom manusia sangat besar dibandingkan dengan panjangnya yang dapat langsung diurutkan sehingga perlu dibagi menjadi beberapa bagian.fragmen. Pada akhirnya, fragmen-fragmen ini diurutkan dengan mencerna salinan setiap fragmen menjadi unit yang lebih kecil lagi menggunakan endonuklease spesifik-urutan untuk mengukur ukuran setiap fragmen kecil menggunakan kromatografi eksklusi ukuran menggunakan informasi ini untuk menentukan di mana fragmen besar saling tumpang tindih..
Untuk mengawetkan unsur-unsur dengan urutan DNA masing-masing, fragmen ditambahkan ke sistem populasi bakteri yang terus berulang. Populasi klon bakteri, masing-masing populasi mempertahankan satu kromosom buatan, disimpan di berbagai laboratorium di seluruh dunia. Kromosom buatan (BAC) dapat ditumbuhkan, diekstraksi, dan diberi label di laboratorium mana pun yang berisi perpustakaan. Perpustakaan genom sering diberi nama sesuai dengan institusi tempat mereka dikembangkan. Contohnya adalah perpustakaan RPCI-11, dinamai Roswell Cancer Institute di Buffalo (New York, AS). Fragmen ini membentuk sekitar 100 ribu pasangan basa dan merupakan dasar dari sebagian besar probe FISH.
