Pewarnaan gram banyak digunakan dalam mikrobiologi karena merupakan salah satu cara termudah untuk membedakan bakteri berdasarkan komposisi dinding selnya. Menurut Gram, semua bakteri dapat dibagi menjadi gram positif (Gram (+)) dan gram negatif (Gram (-)). Metode pewarnaan Gram dikembangkan pada tahun 1884 dan tidak kehilangan popularitas sejak saat itu, meskipun telah dimodifikasi beberapa kali.
Struktur dinding sel
Pewarnaan Gram mengungkapkan apakah bakteri itu Gram-positif atau Gram-negatif. Pembagian bakteri menjadi Gram (+) dan Gram (-) dilakukan sesuai dengan struktur dinding selnya.
Dinding sel mengandung jumlah terbesar peptidoglikan (murein) - zat kompleks, yang meliputi peptapeptide dan glikan. Glisan terdiri dari residu N-asetilglukosamin dan asam N-asetilmuramat yang berselang-seling dihubungkan satu sama lain oleh -1,ikatan 4-glikosidik. Peptidoglikan menyediakan pemeliharaan bentuk sel, perlindungan osmotik, dan fungsi antigenik.
Perbedaan utama antara bakteri Gram-positif dan Gram-negatif
Bakteri yang berbeda memiliki ketebalan lapisan peptidoglikan yang berbeda. Pada bakteri yang tergolong gram positif berkisar antara 15 hingga 80 nm, sedangkan pada gram negatif berkisar antara 2 hingga 8 nm. Pada saat yang sama, bakteri Gram-negatif memiliki struktur khusus di bawah lapisan peptidoglikan, yang tidak dimiliki bakteri Gram-positif - ruang periplasmik. Ruang ini diisi dengan enzim hidrolitik - -laktamase, ribonuklease 1, fosfatase. Enzim inilah yang bertanggung jawab atas resistensi bakteri Gram-negatif terhadap banyak antibiotik.
Lapisan peptidoglikan Gram(-) bakteri terikat pada lipopolisakarida, suatu struktur antigenik yang mengandung endotoksin. Pada bakteri Gram(+), asam teikoat melakukan fungsi yang sama.
Bakteri Gram-negatif memiliki struktur tambahan - membran luar.
Inti dari metode pewarnaan
Sebelum Anda mulai pewarnaan, apusan bakteri yang dipelajari disiapkan. Untuk melakukan ini, air diteteskan ke slide kaca dan biakan mikroorganisme ditambahkan di sana dengan lingkaran bakteri. Kemudian, setelah air benar-benar kering, nodanya diperbaiki - kaca objek dibawa beberapa kali di atas api kompor. Pewarnaan Gram lebih efektif daripada pewarnaan bakteri hidup - molekul pewarna mengikat lebih baik ke sel-sel mati.
Pewarnaan dilakukan dalam beberapa tahap:
- Potongan kecil kertas saring ditempatkan pada apusan tetap dan pewarna utama dituangkan - gentian violet atau biru metilen.
- Setelah 3-5 menit, keluarkan kertas saring berwarna dan isi apusan dengan larutan Lugol selama 1 menit. Dalam hal ini, preparasi menjadi gelap.
- Larutan Lugol dikeringkan dan apusan diperlakukan dengan etil alkohol murni: beberapa tetes diteteskan ke sediaan, dikeringkan setelah 20 detik. Prosedur ini diulangi 2-3 kali.
- Bilas slide uji dengan air suling.
- Menghasilkan pewarnaan tambahan - selesaikan persiapan dengan fuchsin. Setelah 1-2 menit, pewarna dicuci.
- Setelah air mengering, periksa apusan di bawah mikroskop. Bakteri gram positif akan berwarna biru-ungu, bakteri gram negatif akan berwarna merah muda atau merah.
Penyebab pola pewarnaan yang berbeda
Seperti dijelaskan di atas, bakteri Gram-pewarnaan noda biru-ungu bakteri Gram-positif, sedangkan bakteri Gram-negatif pewarnaan merah atau merah muda. Alasan untuk pewarnaan diferensial bakteri dengan metode ini adalah bahwa setelah bentuk gentian violet yang larut memasuki sel, pewarna masuk ke dalam bentuk yodium yang tidak larut. Selama pengobatan bakteri dengan etil alkohol, lipid diekstraksi dari membran di bawah aksi pelarut non-polar ini. Membran kemudian menjadi berpori dan tidak lagi menjadi penghalang yang signifikan untuk pencucian pewarna. Namunpeptidoglikan lebih tahan terhadap pelarut non-polar, termasuk alkohol. Dialah yang mencegah pencucian pewarna, sehingga bakteri dengan lapisan murein yang tebal menjadi biru-ungu (gram positif), dan setelah pengobatan dengan alkohol mereka tidak berubah warna.
Lapisan murein tipis bakteri gram negatif tidak dapat menahan molekul pewarna di dalam sel, jadi setelah aksi alkohol mereka menjadi tidak berwarna - pewarnaan gram negatif.
Setelah apusan terkena fuchsin, bakteri pewarnaan Gram tetap berwarna biru-ungu, sedangkan bakteri Gram-negatif menjadi merah muda-merah.
Contoh Bakteri Gram(+) dan Gram(-)
Bakteri gram negatif termasuk cyanobacteria, bakteri sulfur, bakteri besi, klamidia, riketsia, bakteri asetat, banyak methylobacteria, bakteri thionik, arsenitobacteria, carboxybacteria.
Bifidobacteria, banyak bakteri air, streptokokus dan stafilokokus adalah Gram-positif.
