Saat mempelajari zat dalam kimia organik, lebih dari selusin reaksi kualitatif yang berbeda digunakan untuk menentukan kandungan senyawa tertentu. Analisis visual semacam itu memungkinkan Anda untuk segera memahami apakah zat yang diperlukan ada, dan jika tidak ada, Anda dapat secara signifikan mengurangi eksperimen lebih lanjut untuk mengidentifikasinya. Reaksi ini termasuk ninhidrin, yang merupakan reaksi utama dalam penentuan visual senyawa amino.
Apa ini?
Ninhidrin adalah senyawa dikarbonil yang mengandung satu cincin aromatik dengan heterosiklik yang terikat padanya, atom kedua yang memiliki 2 gugus hidroksil (OH-). Zat ini diperoleh dengan oksidasi langsung inandione - 1, 3, dan, oleh karena itu, menurut nomenklatur internasional, ia memiliki nama berikut: 2, 2 - dihydroxyinandione -1, 3 (Gbr. 1).
Ninhidrin murni adalah kristal kuning atau putihwarna yang, ketika dipanaskan, larut dengan baik dalam air dan pelarut organik polar lainnya, seperti aseton. Ini adalah zat yang agak berbahaya, jika kontak dengan kulit dalam jumlah besar atau selaput lendir menyebabkan iritasi, termasuk jika terhirup. Bekerja dengan senyawa ini harus hati-hati dan hanya dengan sarung tangan, karena ketika bersentuhan dengan kulit, ia bereaksi dengan protein sel kulit dan menodainya dengan warna ungu.
Zat Reaktif
Seperti disebutkan di atas, reaksi ninhidrin digunakan terutama untuk penentuan visual kandungan senyawa amino:
- α-asam amino (termasuk dalam protein);
- gula amino;
- alkaloid yang mengandung gugus –NH2 dan -NH;
- berbagai amina.
Perlu dicatat bahwa amina sekunder dan tersier terkadang bereaksi sangat lemah, sehingga diperlukan lebih banyak penelitian untuk memastikan keberadaannya.
Berbagai metode kromatografi digunakan untuk penentuan kuantitatif, misalnya, kromatografi kertas (BC), kromatografi lapis tipis (KLT) atau dengan pencucian pembawa padat dengan larutan ninhidrin di berbagai media.
Reaksi ini tidak spesifik untuk senyawa amino, karena reagen dapat masuk ke dalamnya sekaligus. Namun, pada bagian dari produk reaksi, ia memiliki kekhasan dalam bentuk pelepasan gelembung karbon dioksida (CO2), dan ini khas hanya ketika berinteraksi dengan -amino. asam.
Fitur mekanisme
BAda interpretasi yang berbeda dari persamaan reaksi ninhidrin dalam literatur. Beberapa peneliti menghilangkan pembentukan hidrindantin dari 2-aminoinandione, yang, dengan partisipasi amonia dan ninhidrin, juga membentuk zat pewarna yang disebut "ungu Rueman" (atau "biru Rueman"), sementara yang lain, sebaliknya, hanya menganggapnya sebagai partisipasi tanpa kehadiran produk amino antara. Ada juga beberapa poin menarik dalam catatan reaksi itu sendiri, khususnya, ini menyangkut metode pengikatan turunan amino ninhidrin ke molekul utamanya untuk membentuk pewarna. Indikasi tempat "hidrogen berjalan" yang diperoleh oleh amina antara dari media berair juga masih dipertanyakan: dapat berupa gugus keton atau di sebelah –NH2.
Pada kenyataannya, nuansa dengan atom H tidak signifikan, karena posisinya dalam senyawa tidak memainkan peran khusus dalam jalannya reaksi, sehingga tidak perlu diperhatikan. Adapun penghilangan salah satu tahap yang mungkin, alasannya di sini terletak pada aspek teoretis: sampai sekarang, mekanisme yang tepat untuk pembentukan ungu Rueman belum ditentukan secara tepat, sehingga skema reaksi ninhidrin yang sangat berbeda dapat ditemukan.
Jalan interaksi yang paling lengkap dari reagen dengan senyawa amino akan diusulkan di bawah ini.
Mekanisme reaksi
Pertama, ninhidrin berinteraksi dengan asam -amino, mengikatnya di tempat pembelahan gugus hidroksi dan membentuk produk kondensasi (Gbr. 2a). Kemudian yang terakhir dihancurkan, melepaskan amina antara, aldehida, dan karbon dioksida (Gbr. 2b). Dari produk akhir saat bergabungninhidrin, struktur ungu Rueman (diketonhidrindenketohidrinamina, Gambar 2c) disintesis. Juga ditunjukkan kemungkinan pembentukan hidrindantin (ninhidrin tereduksi) dari amina antara, yang juga berubah menjadi senyawa pewarna dengan adanya amonia (lebih tepatnya, amonium hidroksida) dengan kelebihan reagen itu sendiri (Gbr. 2d).
Pembentukan hidrindantin dibuktikan oleh Rueman sendiri ketika hidrogen sulfida bekerja pada molekul ninhidrin. Senyawa ini mampu larut dalam natrium karbonat Na2CO3, sehingga larutan berwarna merah tua. Dan ketika asam klorida encer ditambahkan, hidrindantin mengendap.
Kemungkinan besar, amina antara, hidridanthin, ninhidrin dan struktur pewarna, karena ketidakstabilannya saat dipanaskan, berada dalam keseimbangan tertentu, yang memungkinkan adanya beberapa tahap tambahan.
Mekanisme ini cocok untuk menjelaskan reaksi ninhidrin dengan senyawa amino lain, dengan pengecualian produk sampingan yang dihasilkan dari eliminasi sisa struktur dari –NH2, -NH atau -N.
Uji biuret dan reaksi lain terhadap protein
Analisis kualitatif untuk ikatan peptida bahkan struktur non-protein dapat dilakukan tidak hanya dengan partisipasi reagen di atas. Namun, dalam kasus reaksi ninhidrin terhadap protein, interaksi tidak terjadi di sepanjang gugus –CO-NH‒, tetapi di sepanjang gugus amina. Ada yang disebut "reaksi biuret", yang ditandai dengan penambahan ion ke larutan dengan senyawa aminotembaga bivalen dari CuSO4 atau Cu(OH)2 dalam media basa (Gbr. 3).
Selama analisis, dengan adanya struktur yang diperlukan, larutan berubah menjadi biru tua karena pengikatan ikatan peptida menjadi kompleks warna, yang membedakan satu reagen dari yang lain. Itulah sebabnya reaksi biuret dan ninhidrin bersifat universal dalam kaitannya dengan struktur protein dan non-protein dengan gugus –CO-NH‒.
Saat menentukan asam amino siklik, reaksi xantoprotein dengan larutan pekat asam nitrat HNO3 digunakan, yang memberikan warna kuning saat nitrasi. Setetes reagen pada kulit juga menunjukkan warna kuning dengan bereaksi dengan asam amino dalam sel-sel kulit. Asam nitrat dapat menyebabkan luka bakar dan juga harus ditangani dengan sarung tangan.
Contoh interaksi dengan senyawa amino
Reaksi ninhidrin untuk asam -amino memberikan hasil visual yang baik, kecuali untuk struktur warna prolin dan hidroksiprolin, yang bereaksi dengan pembentukan warna kuning. Penjelasan yang mungkin untuk efek ini ditemukan pada kondisi lingkungan lain dari interaksi ninhidrin dengan struktur ini.
Reaksi dengan gugus amino
Karena tes ini tidak spesifik, deteksi visual alanin menggunakan reaksi ninhidrin dalam campuran tidak mungkin dilakukan. Namun, dengan kromatografi kertas, ketika menerapkan sampel berbagai asam -amino, menyemprotkannya dengan larutan ninhidrin berair dan berkembang dalam media khusus, seseorang dapatmenghitung komposisi kuantitatif tidak hanya senyawa yang diklaim, tetapi juga banyak lainnya.
Secara skema, interaksi alanin dengan ninhidrin mengikuti prinsip yang sama. Ini menempel pada reagen pada gugus amina, dan di bawah aksi ion hidronium aktif (H3O+) terpecah di karbon -ikatan nitrogen, terurai menjadi asetaldehida (CH3COH) dan karbon dioksida (CO2). Molekul ninhidrin lain menempel pada nitrogen, menggantikan molekul air, dan membentuk struktur pewarnaan (Gbr. 4).
Reaksi dengan senyawa amino heterosiklik
Reaksi ninhidrin dengan prolin adalah spesifik, terutama dalam analisis kromatografi, karena struktur seperti itu dalam media asam pertama-tama berubah menjadi kuning, dan kemudian menjadi ungu dalam media netral. Para peneliti menjelaskan hal ini dengan ciri penataan ulang siklus dalam senyawa antara, yang dipengaruhi secara tepat oleh keberadaan sejumlah besar proton hidrogen yang melengkapi tingkat energi eksternal nitrogen.
Pemusnahan heterosiklus tidak terjadi, dan molekul ninhidrin lain melekat padanya pada atom karbon ke-4. Setelah pemanasan lebih lanjut, struktur yang dihasilkan dalam media netral berubah menjadi ungu Rueman (Gbr. 5).
Persiapan reagen utama
Uji ninhidrin dilakukan dengan larutan yang berbeda, tergantung pada disolusi struktur amino dalam senyawa organik dansenyawa anorganik.
Reagen utama adalah pembuatan larutan 0,2% dalam air. Ini adalah campuran serbaguna, karena sebagian besar senyawa larut dengan baik dalam H2O. Untuk mendapatkan reagen yang baru disiapkan, sampel 0,2 g ninhidrin murni kimia diencerkan dalam 100 ml air.
Perlu dicatat bahwa untuk beberapa larutan yang dianalisis, konsentrasi ini tidak mencukupi, sehingga larutan 1% atau 2% dapat disiapkan. Hal ini khas untuk ekstrak dari bahan baku obat, karena mengandung berbagai kelas senyawa amino.
Saat melakukan studi kromatografi, larutan, misalnya, saat mencuci campuran pada pembawa padat melalui kolom, dapat dibuat dalam alkohol, dimetil sulfoksida, aseton, dan pelarut polar lainnya - semuanya akan tergantung pada pelarut tertentu struktur amino.
Aplikasi
Reaksi ninhidrin memungkinkan untuk mendeteksi banyak senyawa amino dalam larutan, yang menjadikannya salah satu yang pertama digunakan dalam analisis kualitatif zat organik. Penentuan visual secara signifikan mengurangi jumlah percobaan, terutama ketika menganalisis tanaman yang kurang dipelajari, obat-obatan dan bentuk sediaan, serta larutan dan campuran yang tidak diketahui.
Dalam ilmu forensik, metode ini banyak digunakan untuk menentukan keberadaan tanda keringat di permukaan apapun.
Meskipun reaksi tidak spesifik, penarikan reaksi ninhidrin dari praktik kimia tidak mungkin, karenamengganti zat ini dengan analog yang kurang beracun (misalnya, oxolin) membuktikan bahwa mereka memiliki sensitivitas yang lebih rendah terhadap gugus amino dan tidak memberikan hasil yang baik dalam analisis fotometrik.
