Penyerapan dan emisi kembali cahaya lebih lanjut oleh media anorganik dan organik adalah hasil dari pendar atau fluoresensi. Perbedaan antara fenomena adalah panjang interval antara penyerapan cahaya dan emisi aliran. Dengan fluoresensi, proses ini terjadi hampir bersamaan, dan dengan pendar, dengan beberapa penundaan.
Latar belakang sejarah
Pada tahun 1852, ilmuwan Inggris Stokes pertama kali mendeskripsikan fluoresensi. Dia menciptakan istilah baru sebagai hasil eksperimennya dengan fluorspar, yang memancarkan cahaya merah saat terkena sinar ultraviolet. Stokes mencatat fenomena menarik. Ia menemukan bahwa panjang gelombang cahaya fluoresen selalu lebih panjang daripada cahaya eksitasi.
Banyak eksperimen dilakukan pada abad ke-19 untuk mengkonfirmasi hipotesis. Mereka menunjukkan bahwa berbagai sampel berpendar ketika terkena sinar ultraviolet. Bahan yang termasuk antara lain kristal, resin, mineral, klorofil,bahan baku obat, senyawa anorganik, vitamin, minyak. Penggunaan langsung pewarna untuk analisis biologis baru dimulai pada tahun 1930
Deskripsi mikroskop fluoresensi
Beberapa bahan yang digunakan dalam penelitian pada paruh pertama abad ke-20 sangat spesifik. Berkat indikator yang tidak dapat dicapai dengan metode kontras, metode mikroskop fluoresensi telah menjadi alat penting dalam penelitian biomedis dan biologi. Hasil yang diperoleh tidak sedikit untuk ilmu material.
Apa manfaat mikroskop fluoresensi? Dengan bantuan bahan baru, menjadi mungkin untuk mengisolasi sel yang sangat spesifik dan komponen submikroskopik. Mikroskop fluoresen memungkinkan Anda mendeteksi molekul individu. Berbagai pewarna memungkinkan Anda mengidentifikasi beberapa elemen secara bersamaan. Meskipun resolusi spasial peralatan dibatasi oleh batas difraksi, yang, pada gilirannya, tergantung pada sifat spesifik sampel, deteksi molekul di bawah level ini juga sangat mungkin. Berbagai sampel menunjukkan autofluoresensi setelah iradiasi. Fenomena ini banyak digunakan dalam petrologi, botani, industri semikonduktor.
Fitur
Studi tentang jaringan hewan atau mikroorganisme patogen sering kali diperumit oleh autofluoresensi non-spesifik yang terlalu lemah atau sangat kuat. Namun, nilai dalampenelitian memperoleh pengenalan ke dalam bahan komponen yang tereksitasi pada panjang gelombang tertentu dan memancarkan fluks cahaya dengan intensitas yang diperlukan. Fluorokrom bertindak sebagai pewarna yang mampu menempel pada struktur (tidak terlihat atau terlihat). Pada saat yang sama, mereka dibedakan oleh selektivitas tinggi sehubungan dengan target dan hasil kuantum.
Mikroskopi fluoresensi telah digunakan secara luas dengan munculnya pewarna alami dan sintetis. Mereka memiliki profil intensitas emisi dan eksitasi yang spesifik dan ditujukan pada target biologis tertentu.
Identifikasi molekul individu
Seringkali, dalam kondisi ideal, Anda dapat mendaftarkan pancaran satu elemen. Untuk melakukan ini, antara lain, perlu memastikan kebisingan detektor dan latar belakang optik yang cukup rendah. Sebuah molekul fluorescein dapat memancarkan hingga 300.000 foton sebelum dihancurkan karena photobleaching. Dengan tingkat pengumpulan 20% dan efisiensi proses, mereka dapat didaftarkan dalam jumlah sekitar 60 ribu
Mikroskop fluoresensi, berdasarkan fotodioda longsoran atau penggandaan elektron, memungkinkan peneliti untuk mengamati perilaku molekul individu selama beberapa detik, dan dalam beberapa kasus beberapa menit.
Kesulitan
Masalah utamanya adalah peredam bising dari latar belakang optik. Karena fakta bahwa banyak bahan yang digunakan dalam konstruksi filter dan lensa menunjukkan beberapa autofluoresensi, upaya para ilmuwan pada tahap awal difokuskan untuk mengeluarkankomponen dengan fluoresensi rendah. Namun, percobaan selanjutnya menghasilkan kesimpulan baru. Secara khusus, mikroskop fluoresensi berdasarkan refleksi internal total telah ditemukan untuk mencapai keluaran cahaya latar belakang rendah dan eksitasi tinggi.
Mekanisme
Prinsip mikroskop fluoresensi berdasarkan refleksi internal total adalah menggunakan gelombang yang cepat meluruh atau tidak merambat. Itu muncul pada antarmuka antara media dengan indeks bias yang berbeda. Dalam hal ini, berkas cahaya melewati prisma. Memiliki indeks bias yang tinggi.
Prisma berdekatan dengan larutan berair atau kaca parameter rendah. Jika berkas cahaya diarahkan pada sudut yang lebih besar dari sudut kritis, berkas dipantulkan sepenuhnya dari antarmuka. Fenomena ini, pada gilirannya, menimbulkan gelombang yang tidak merambat. Dengan kata lain, medan elektromagnetik yang dihasilkan menembus media dengan indeks bias lebih rendah pada jarak kurang dari 200 nanometer.
Dalam gelombang yang tidak merambat, intensitas cahaya akan cukup untuk membangkitkan fluorofor. Namun, karena kedalamannya yang sangat dangkal, volumenya akan sangat kecil. Hasilnya adalah latar belakang tingkat rendah.
Modifikasi
Mikroskop fluoresensi berdasarkan refleksi internal total dapat direalisasikan dengan epi-iluminasi. Ini membutuhkan lensa dengan bukaan numerik yang ditingkatkan (setidaknya 1,4, tetapi diinginkan bahwa itu mencapai 1,45-1,6), serta bidang peralatan yang diterangi sebagian. Yang terakhir dicapai dengan titik kecil. Untuk keseragaman yang lebih besar, cincin tipis digunakan, yang melaluinya bagian aliran terhalang. Untuk mendapatkan sudut kritis setelah pemantulan total terjadi, diperlukan pembiasan tingkat tinggi dari media perendaman dalam lensa dan kaca penutup mikroskop.
