Pembudidayaan bakteri: metode, prinsip, langkah, dan kondisi

2024 Pengarang: Angel Austin | [email protected]. Terakhir diubah: 2023-12-17 05:30

Mikroorganisme di alam sekitar kita ada di mana-mana: di tanah, badan air, di permukaan berbagai benda, manusia dan hewan dihuni oleh mereka. Semua ini dapat berfungsi sebagai sumber kontaminasi mikroba pada makanan, obat-obatan, dan jalur produksi. Budidaya bakteri diperlukan untuk mempelajari sifat, kebutuhan, dan karakteristiknya. Ini, pada gilirannya, merupakan langkah penting dalam pengembangan berbagai obat, diagnosis laboratorium penyakit, perhitungan reaktor produksi, dan banyak lagi.

Konsep umum

Budidaya bakteri dalam mikrobiologi mengacu pada budidaya mikroorganisme yang dilakukan di laboratorium. Pada gilirannya, mikroba yang telah tumbuh pada media nutrisi yang dipilih disebut kultur. Kultur dapat dicampur jika dibentuk oleh berbagai jenis mikroorganisme, dan murni jika hanya diwakili oleh satu jenis bakteri.

Jika bergiziHanya satu sel yang ditempatkan dalam medium, dan diperoleh sekelompok individu sebagai hasil reproduksinya, maka kumpulan mikroorganisme ini disebut klon. Ketika klon berkembang ke titik di mana ia dapat dilihat dengan mata telanjang, kumpulan bakteri ini disebut koloni.

Biasanya budidaya bakteri yang diisolasi dari sumber yang berbeda dilakukan secara terpisah satu sama lain. Setiap kelompok mikroba yang tumbuh secara terpisah disebut strain. Jadi, jika satu jenis staphylococcus diisolasi dari tiga sumber (atau bagian yang berbeda dari produk yang sama, orang yang berbeda), mereka berbicara tentang tiga jenis staphylococcus jenis ini.

Faktor Pertumbuhan Bakteri

Ini termasuk berbagai asam amino, lipid, basa purin dan senyawa lain yang diperlukan untuk pengembangan mikroorganisme. Beberapa mikroba dapat secara mandiri menghasilkan zat yang mereka butuhkan, sementara yang lain perlu menerimanya dalam bentuk jadi. Sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme pada faktor pertumbuhan tertentu, identifikasi dan diferensiasi bakteri dilakukan. Juga, parameter ini penting untuk persiapan media nutrisi yang benar untuk pekerjaan laboratorium dan bioteknologi:

• asam amino. Bakteri mungkin memerlukan satu asam amino atau kelompok asam tertentu. Jadi, clostridia membutuhkan leusin dan tirosin, streptokokus membutuhkan leusin dan arginin. Mikroorganisme yang membutuhkan asam amino dari luar untuk tumbuh disebut auksotrof.
• Basa purin dan pirimidin, serta turunannya (adenin, guanin, dan lainnya). Mereka adalah faktor penting dalam pertumbuhan banyakspesies Streptococcus.
• Vitamin. Mereka adalah bagian dari koenzim yang dibutuhkan oleh bakteri. Jadi, asam nikotinat, serta amidanya, yang merupakan bagian dari NAD dan NADP, dibutuhkan oleh difteri dan shigella corynebacteria. Tiamin, sebagai bagian integral dari pirofosfat, dibutuhkan oleh Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. Asam pantotenat, yang merupakan bagian dari koenzim CoA, dibutuhkan oleh basil tetanus dan beberapa jenis streptokokus. Sitokrom, dan karena itu asam folat, heme, dan biotin yang membentuknya, diperlukan untuk Mycobacterium tuberculosis dan Haemophilus influenzae.

Persyaratan Lingkungan

Kondisi media kultur untuk kultur bakteri:

1. Nutrisi. Mereka harus mengandung zat, apalagi, dalam bentuk yang mudah dicerna, yang diperlukan bagi mikroorganisme untuk memberi makan dan mengisi kembali energi. Ini termasuk organogen dan mineral. Beberapa mikroorganisme juga membutuhkan vitamin dan asam amino yang tidak dapat mereka sintesis.
2. Tingkat pH optimal. Ini mempengaruhi permeabilitas membran sel dan, karenanya, kemampuan untuk menyerap nutrisi oleh bakteri. Paling sering, nilai pH harus pada tingkat 7, 2-7, 4. Banyak mikroorganisme dalam perjalanan hidupnya menghasilkan produk dengan reaksi asam atau basa, dan agar pH media nutrisi tidak berubah, itu harus disangga.
3. Isotonik. Tekanan osmotik dalam media nutrisi untuk budidaya bakteri harus memiliki nilai yang sama dengandi dalam sel mikroba. Biasanya sesuai dengan larutan NaCl 0,5%.
4. Sterilitas. Hal ini disebabkan munculnya bakteri asing akan mengganggu hasil studi dari strain yang dianalisis.
5. Tingkat kelembapan. Indikator ini, bersama dengan konsistensi medium, harus memiliki karakteristik yang optimal untuk jenis bakteri tertentu.
6. Potensi redoks (RH2). Ini menunjukkan rasio zat yang menyumbangkan dan menerima elektron, serta tingkat saturasi oksigen dari media nutrisi. Untuk aerob dan anaerob, kondisi untuk budidaya bakteri agak berbeda dalam indikator ini. Mikroorganisme anaerob bereproduksi paling baik pada nilai RH2 di bawah 5 dan mikroorganisme aerob minimal 10.
7. Keseragaman. Adalah penting bahwa media kultur mengandung bahan-bahan individual dalam jumlah yang konstan. Selain itu, solusi yang jelas lebih disukai, yang memudahkan untuk memantau pertumbuhan tanaman atau melihat kontaminasi.

Jenis media kultur

Pemilihan media tertentu untuk menumbuhkan mikroorganisme dipengaruhi oleh banyak faktor, di antaranya karakteristik nutrisi dan tujuan penelitian. Fitur utama yang mendasari klasifikasi media nutrisi adalah:

1. Komponen. Menurut zat awal yang digunakan untuk membuat substrat, mereka membedakan:

• alami, yang dibuat dari produk hewani atau nabati (misalnya daging, susu, buah) dan cocok untuk ditanam campurantanaman;
• semi-sintetis, di mana produk makanan alami yang mahal digantikan oleh produk non-makanan (misalnya, tepung tulang, pembekuan darah), dan yang optimal untuk membudidayakan jenis bakteri tertentu atau mengisolasi produk metabolisme mereka dari lingkungan;
• sintetis, yang dibuat dari senyawa kimia dalam jumlah yang tepat, memiliki komposisi konstan yang diketahui dan mudah direproduksi.

2. Konsistensi (kepadatan). Bedakan lingkungan:

• cair;
• padat;
• semi cair.

Dua yang terakhir dibuat dari larutan khusus atau zat cair dengan penambahan agar-agar atau gelatin untuk menciptakan kepadatan yang dibutuhkan. Selain itu, lingkungan yang padat untuk pertumbuhan bakteri adalah serum darah yang menggumpal, kentang, media silika gel, karagenan.

3. Menggabungkan. Atas dasar ini, lingkungan adalah:

• simple, daftarnya singkat adalah Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), nutrient gelatin dan peptone water.
• kompleks, dibuat dari yang sederhana dengan tambahan darah, whey, karbohidrat dan zat lainnya.

4. Janji temu. Media nutrisi berikut dibedakan:

• main digunakan untuk menumbuhkan banyak mikroba patogen (biasanya komposisinya sederhana);
• yang khusus digunakan untuk mengisolasi dan membudidayakan bakteri yang tidak tumbuh pada substrat sederhana;
• selektif (mereka juga selektif) cocok untuk mengisolasi jenis bakteri tertentu dan menghambat pertumbuhan mikroba terkait (selektivitasdibuat dengan menambahkan zat tertentu ke dalam media, seperti antibiotik atau garam, atau dengan mengatur pH);
• diagnosis diferensial memungkinkan untuk membedakan satu jenis bakteri dari yang lain dengan menilai aktivitas enzimatik, misalnya, medium;
• pengawet diperlukan untuk inokulasi awal dengan pengangkutan sampel berikutnya, karena mereka mencegah kematian mikroorganisme, serta menghambat pertumbuhan bakteri lain.

Persiapan media

Langkah terpenting dalam budidaya bakteri anaerob adalah persiapan media nutrisi yang sesuai. Setelah parameter optimal dipilih, lanjutkan ke tahapan berikut:

• penimbangan, dengan memilih sampel komponen pada neraca analitik;
• pelarutan dilakukan dalam air suling yang dipanaskan hingga 70 ° C, dan fosfat, garam mikro dan makro dilarutkan secara terpisah;
• merebus dalam penangas air selama dua menit;
• penentuan pH dengan kertas indikator atau potensiometer;
• filtrasi melalui kain basah atau kertas saring untuk media padat cair maupun cair, dan melalui filter kasa kapas untuk media agar;
• pembotolan dilakukan pada kapasitas 3/4;
• sterilisasi bergantung sedang;
• kontrol sterilitas dilakukan dengan cara didiamkan selama dua hari dalam termostat, dilanjutkan dengan melihat;
• kontrol kimia untuk menetapkan pH dan kandungan yang diperlukanbarang;
• pengendalian hayati dengan inokulasi percobaan.

Sterilisasi barang pecah belah dan media

Salah satu prinsip dasar budidaya bakteri adalah sterilitas. Pertumbuhan dan perkembangan mikroorganisme asing dapat mempengaruhi karakteristik media nutrisi dengan mengubah komposisi kimia dan pH. Sterilisasi adalah syarat utama untuk menumbuhkan kultur murni. Dalam praktiknya, istilah ini berarti metode penghancuran secara mutlak semua bentuk kehidupan di permukaan dan dalam volume benda yang disterilkan. Bejana, instrumen yang digunakan, media, dan barang-barang lain yang digunakan selama penelitian disterilkan.

Beberapa jenis sterilisasi:

• Pengapian. Sterilisasi loop dan jarum untuk pembibitan, slide kaca, beberapa instrumen dapat dilakukan dengan menggunakan pembakar atau lampu spiritus.
• Mendidih. Cocok untuk menangani jarum suntik, jarum, makanan, tetapi tidak membunuh spora bakteri.
• Sterilisasi panas kering. Ini dilakukan dalam lemari pengering khusus dan cocok untuk memproses labu, tabung reaksi, dan peralatan gelas laboratorium lainnya.
• Sterilisasi uap. Dilakukan dalam autoklaf, metode ini sangat efektif. Tetapi tidak cocok untuk media nutrisi yang mengandung protein atau senyawa lain yang terurai pada suhu tinggi. Lebih hemat bisa disebut tyndalisasi. Ini dilakukan di Koch Boiler dan menggabungkan perkecambahan spora dengan penghancurannya.
• Pasteurisasi. Ini digunakan untuk media yang mengubah sifat-sifatnya ketika direbus (misalnya, susu, anggur, bir), yang mampu:membersihkan mereka dari mikroorganisme non-spora-bantalan. Suhu pemrosesan hanya 50-60 ° C selama lima belas hingga tiga puluh menit. Dalam beberapa kasus, sterilisasi dingin digunakan, dilakukan dengan menggunakan filter atau sinar UV.

Kondisi budidaya bakteri

Pertumbuhan dan perkembangan bakteri hanya dimungkinkan di bawah faktor-faktor tertentu dan nilainya masing-masing:

1. Suhu. Ada tiga kelompok bakteri yang berbeda dalam preferensi suhu:

• thermophiles, atau mikroba yang menyukai panas, tumbuh pada suhu 45-90 °C, yang berarti mereka tidak berkembang biak pada organisme manusia dan hewan;
• psychrophiles, atau mikroorganisme yang menyukai dingin, lebih menyukai suhu di kisaran 5-15 ° C dan tumbuh di toko dingin;
• mesofil, berkembang pada suhu 25-37 ° C, mereka termasuk sebagian besar bakteri.

2. Lampu. Ini adalah fitur budidaya bakteri fototrofik, karena mereka melakukan proses fotosintesis. Tetapi bagi sebagian besar mikroba, pencahayaan bukanlah prasyarat. Dan bahkan sebaliknya, ultraviolet matahari dapat menekan perkembangannya.

3. Air. Semua mikroorganisme membutuhkan air dalam bentuk yang dapat diakses (cair). Itu sebabnya makanan beku memiliki sedikit atau tidak ada pertumbuhan bakteri.

4. Keasaman lingkungan. Prinsip budidaya bakteri ini telah dibahas secara rinci di atas.

5. Aerasi. Oksigen, sebagai unsur kimia, merupakan bagian integral dari air dan sejumlah besar senyawa yang digunakan untukbudidaya mikroorganisme. Gas oksigen juga dapat terkandung dalam air dan cairan lain dalam bentuk terlarut. Sebagian besar bakteri membutuhkan pasokan molekul oksigen yang konstan. Tetapi untuk sejumlah mikroorganisme, itu tidak perlu, atau, lebih buruk, oksigen gas beracun bagi mereka, karena mereka tidak memiliki katalase dan peroksidase, yang menghancurkan produk pernapasan beracun. Oleh karena itu, langkah terpenting dalam budidaya bakteri anaerobik adalah penghilangan molekul O₂ dari media nutrisi.

6. Budidaya mikroorganisme. Budidaya bakteri aerob dan anaerob dilakukan di berbagai lapisan lingkungan dan dalam mode yang berbeda.

Budidaya Mikroorganisme Aerobik

Budidaya bakteri aerob membutuhkan oksigen molekuler. Untuk mendapatkan biakan aerob murni yang dapat berhasil digunakan dalam pengobatan dan industri makanan, metode berikut digunakan:

• permukaan tumbuh pada media padat atau media cair (lapisan tipisnya) ketika oksigen datang langsung dari udara;
• penanaman dalam dalam media cair, ketika peningkatan jumlah oksigen terlarut di dalamnya dicapai dengan aerasi konstan.

Pembudidayaan mikroorganisme anaerob

Prinsip dasar budidaya bakteri jenis ini adalah kontak minimal mereka dengan oksigen atmosfer. Menyediakan kondisi untuk pertumbuhan mereka jauh lebih sulit daripada aerob. Metode berikut digunakan untuk mengisolasi anaerob dari molekul O₂:

1. Fisik. Metode kultivasi bakteri anaerobik ini direduksi menjadi kultivasinya dalam peralatan vakum khusus - mikroanaerostat. Udara di dalamnya diganti dengan campuran gas khusus nitrogen dengan penambahan 10% hidrogen dan 5% karbon dioksida.
2. Kimia. Ini termasuk: penggunaan agen penyerap (misalnya Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) atau zat pereduksi (seperti asam askorbat).
3. Biologis. Itu datang ke ko-kultivasi aerob dan anaerob dalam sistem tertutup. Metode budidaya bakteri ini melibatkan penyemaian satu setengah cawan Petri dengan beberapa spesies bakteri aerob, dan setengah lainnya dengan bakteri anaerob yang dipelajari. Pengembangannya akan dimulai pada saat semua oksigen habis.

Metode penyemaian berikut cocok untuk membudidayakan bakteri anaerob:

• di lapisan permukaan;
• di lapisan permukaan diisi parafin steril;
• di media padat nutrisi yang kental;
• di lapisan media kental yang dalam.

Mendapatkan budaya murni

Ahli mikrobiologi biasanya bekerja dengan sampel yang dihuni oleh berbagai jenis mikroba. Namun, untuk menentukan posisi sistematis mikroorganisme (famili, genus, spesies), serta mempelajari karakteristiknya, perlu diisolasi dan ditumbuhkan kultur murni. Mereka sangat penting dalam banyak industri makanan, misalnya, keju, roti, kvass, anggur, dll. Budidaya bakteri asam laktat memungkinkan untuk memperolehkomponen penting untuk produksi produk susu fermentasi, adonan, kakao, silase dan bahkan plastik.

Metode mengisolasi kultur murni dalam medium padat didasarkan pada pemisahan mekanis sel mikroorganisme dengan kultivasi terisolasi berikutnya. Sampel dipindahkan ke dalam volume air atau garam steril (volume 10-100 ml) dan kemudian dikocok selama dua menit. Untuk mengekstraksi mikroorganisme yang terletak di ketebalan bahan yang diteliti (misalnya, sosis atau keju), pertama-tama dilakukan penggosokan potongan sampel dengan instrumen steril dengan pasir. Bahan yang telah mengalami persiapan pendahuluan, dengan berat 1 g atau volume 1 ml, diencerkan dengan air steril sebanyak 10, 100, 1000, dst. Derajat pengenceran dipilih yang memberikan konsentrasi sel yang sesuai dengan kemampuan metode.

Pembudidayaan mikroorganisme selanjutnya adalah menyiapkan media nutrisi. Biasanya media padat (MPA) dipilih. Ini pertama-tama dicairkan dan didinginkan hingga 45-50 ° C, dan baru kemudian dituangkan ke dalam beberapa cawan Petri (tiga hingga lima potong), di bagian bawahnya ditempatkan penyeka dari zat uji dengan berbagai konsentrasi. Selanjutnya dilakukan pencampuran antara media nutrisi yang masih belum beku dan bahan yang dimasukkan ke dalamnya. Beginilah cara sel difiksasi pada berbagai titik dalam volume substrat.

Selanjutnya, cawan Petri ditempatkan dalam termostat selama 2 hari pada suhu 22 °C. Selama waktu ini, sel-sel berkembang biak sedemikian rupa sehingga koloni yang dibentuk oleh masing-masing sel menjadi terlihat dengan mata telanjang. Masing-masing adalah kultur murni dari jenis bakteri yang selnyamawar.

Setelah itu, dari cawan Petri, mikroorganisme disubkultur ke dalam tabung reaksi terpisah yang diisi dengan media nutrisi. Dengan cara ini, kultur murni diisolasi dari sampel campuran. Metode ini menyandang nama pengembangnya - R. Koch. Ini juga biasa disebut metode cangkir, atau penaburan habis. Setelah mendapatkan biakan murni dari berbagai jenis bakteri, bentuk, spora, dan familinya ditentukan.

Semua pekerjaan harus dilakukan sesuai dengan prinsip asepsis. Untuk menghindari perkembangan dini mikroorganisme, penelitian harus dilakukan segera setelah pengambilan sampel. Air keran dianalisis setelah mengeringkan bagian pertama, karena mungkin mengandung mikroba yang terakumulasi dalam pipa dan keran. Mikroflora buah-buahan, beri dan sayuran terutama terletak di permukaan (kupas), oleh karena itu, pencucian dilakukan darinya. Untuk melakukan ini, tempatkan janin dalam wadah steril dan isi dengan jumlah air yang dibutuhkan. Kemudian mereka dikocok dengan kuat dan airnya dituangkan ke wadah lain. Tanaman dari produk kain juga diperoleh dengan swab, tetapi sebelumnya dipotong-potong dengan ukuran tertentu.